刘 波 ，王 涤，刘 颖，景 伟，杨圆圆，吴 壮，陈明星

（1.黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨 150000；2.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040）

缺氧缺血性脑损伤（Hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）是新生儿在围产期内由多种原因引发的脑组织缺氧缺血，该病常常会遗留一些运动障碍、癫痫等神经功能障碍，严重者可危及生命[1]，而致使脑部受损的其中一个关键原因为细胞凋亡。针康法是治疗脑卒中康复的新型方法，是把头穴丛刺法与现代康复治疗技术联合起来，可有效改善缺氧缺血性脑损伤患者的运动功能障碍，并通过调节细胞凋亡相关蛋白及信号通路等修复损伤脑神经[2-4]。研究表明[5]，PI3K/Akt 信号通路是缺血再灌注后引发细胞凋亡过程的重要通路，而 14-3-3 蛋白因子会在这个通路中表现其抗凋亡的功能。本实验采用原位末端标记法（TUNEL 法）、免疫组化法以及免疫印迹法（Western blot 法）来观察针康法在不同时段对缺氧缺血性脑损伤的新生大鼠的脑皮质神经细胞凋亡以及 Akt、14-3-3 蛋白表达的影响。

7 日龄新生 Wistar 大鼠（上海斯莱克），雌雄不限，质量 11～ 15 g 。随机分为 5 组：A 组（假手术组）、B 组（模型组）、C 组（针刺组）、D 组（康复组）和E 组（针刺加康复组），每组再分为 24 h、72 h 和7 d 3 个亚组，每组 6 只。A 和B 组均不作针刺及康复处理。5 组新生大鼠均采用相同方式喂养，生活环境也一致。8%O2和92%N2混合气体（哈尔滨鼎新工业气体）；华佗牌针灸针 0.25 mm×25 mm 无菌一次性（北京中研太和医疗器械）；2135 型切片机（德国菜卡）；转棒疲劳仪（上海欣软）；3000 显微摄影成像系统（美国moticam）；电热恒温箱（上海一恒）；Fresco 低温冷冻离心、MultiSkan3 酶标仪（Thermo）；电泳仪（Bio-Rad）。兔抗 Akt 一抗、14-3-3 抗体（北京博奥森）；PV6001 二抗（北京中杉）；TUNEL 法检测试剂盒（美国罗氏）；山羊抗兔 IgG（H+L），HRp、内参抗体GAPDH 鼠单抗（天德悦）；BCA 蛋白定量试剂盒（碧云天）；ECL 发光液（Millipore）。

2.1 动物模型制备 新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型制备采用 Rice-vannucci 方法[6]，将大鼠用乙醚麻醉，固定于仰卧位，暴露颈部表皮，局部消毒后，沿颈部正中线剪开皮肤后分离左侧颈总动脉，并采用双结扎，术后缝合颈部表皮。再将大鼠放回窝内，休息 2 h 后，放入有机玻璃缺氧箱内，温度 37 ℃，再以气流速度为0.5 L/min 通入 8% 氧、92% 氮的混合气体，2 h 后取出，出现夹尾左旋者为建模成功，纳入实验。A 组只将表皮剪开并将左侧颈总动脉显露于外，不结扎也不放入缺氧箱中，缝合后放回。

2.2 针刺及康复方法 针刺治疗主要采用于致顺的头穴丛刺法[7]，穴位皮肤常规消毒后，选取百会及百会左、右侧各旁开 1 mm 处针刺，用手快速捻针 1 min 后，留置 2 h，每日 1 次。康复训练主要予以转笼、转棒等康复方法。转笼长至 1 m，直径 0.6 m，为圆柱形网笼，有 4 小格，转棒为长度 0.75 m，直径 4.5 cm 的木棒,其两端可用手顺或逆时针旋转，转速 5 r/min，每日均训练 10 min。针康组则将上述针刺和康复2 种方法同时进行，每日 1 次。C、D 和 E 组均为术后清醒后开始相应治疗，然后分别在治疗后 24 h、72 h 以及 7 d 后处死、取脑。所有新生大鼠在治疗过程中无间歇。

2.3 神经功能损伤评分 选用 Bederson 法[8]，盲评各组手术后新生大鼠的神经功能。0 分：无神经功能缺损症状；1 分：把鼠尾提起并远离地面，非受损侧前侧肢体不能进行伸展活动；2 分：轻推位于地面的大鼠身体两侧，非受损侧抗力减弱；3 分：大鼠步行时向非损伤侧旋转甚至倾倒；4 分：大鼠不能自由行走甚至无法正常站立。

2.4 脑组织采集和固定 分为两部分，一部分是将大鼠用乙醚麻醉后，打开胸腔，剪去心脏的右心耳部位，然后从左心尖处依次注入生理盐水和溶液 4% 多聚甲醛（paraformaldehyde,PA）开始心脏灌注，直至大鼠肺脏变白，肢体强直时立即断头、取大脑，随后立即放入 4%PA 溶液中固定。另一部分则不经过心脏灌注，麻醉取脑后置于瓶中，随后立即放入液氮中 5 min，最后放于-80 ℃冰箱中保存。

2.5 脑细胞凋亡的检测 将脑组织经 4%PA 溶液中取出，常规脱水，石蜡包埋，切片，厚 4 μm，运用原位末端标记技术（TUNEL 法）检测试剂盒进行处理，在400 倍显微镜下观察大脑皮质中的细胞，表达的阳性细胞为黄色或黄棕色或棕黑色，每只大鼠随机选取 5张切片观察，取平均值记录凋亡数量。

2.6 Akt 蛋白表达的检测 取出在 4%PA 溶液中的脑组织，脱水，石蜡包埋，然后常规脱蜡到水化，PBS冲洗后加入一抗，冲洗，再滴加二抗，冲洗，DAB 显色 5～ 10 min。再用苏木素染色，然后以中性树胶为材料封片，最终置于高倍镜下。应用 Image-pro plus 6.0病理图像分析系统对阳性表达进行分析，以积分光密度（IOD 值）代表蛋白 Akt 相对表达量，每只鼠均随机观测 5 个镜下视野，得其平均值。

2.7 14-3-3 蛋白表达的检测 将大脑从-80 ℃冰箱内拿出后，放入裂解液，然后进行3次匀浆，再以 4 ℃离心，13 000 r/20 min，离心完成后取上清，用 BCA 法将蛋白定量，上样量为 20 μg/孔，然后进行电泳、转膜、染色后，封闭 30 min。加入 14-3-3（1:1 000）一抗，孵育10 min，放 4 ℃过夜。加入山羊抗兔 IgG（H+L）HRp（1:10 000）二抗，室温轻摇 40 min。洗膜后把 ECL 发光液加到膜上等候，再显影 2 min 后，最终进行扫描。内参 GAPDH 鼠单抗（1:20 000）检测过程与目标蛋白相同。运用 Gel-Pro-Analyzer 4.0 分析条带灰度值，以目标蛋白条带灰度值/GAPDH 鼠单抗条带灰度值为该样本目标蛋白相对表达量。

3.1 不同时间点各组 Bederson 评分比较 见表 1。

表1 不同时间点各组 Bederson 评分比较（，n =6）

表1 不同时间点各组 Bederson 评分比较（，n =6）

注：与 A 组比较，## P ＜0.01；与 B 组比较，△P ＜ 0.05；与 C组比较，▲P ＜0.05；与 D 组比较，□P ＜0.05

3.2 不同时间点各组脑凋亡阳性细胞数比较 见表 2。

表2 不同时间点各组脑凋亡阳性细胞数比较（，n =6） （个/400 倍）

表2 不同时间点各组脑凋亡阳性细胞数比较（，n =6） （个/400 倍）

注：与 A 组比较，## P ＜0.01；与 B 组比较，△△P ＜0.01；与 C组比较，▲P ＜0.05；与 D 组比较，□P ＜0.05

3.3 不同时间点各组脑组织 Akt、14-3-3 蛋白表达比较 见表 3、表 4。

表3 不同时间点各组脑组织 Akt 蛋白表达比较（，n =6）

表3 不同时间点各组脑组织 Akt 蛋白表达比较（，n =6）

注：与 A 组比较，# P ＜0.05；与 B 组比较，△P ＜0.05；与 C 组比较，▲P ＜0.05；与 D 组比较，□P ＜0.05

针刺疗法可改善脑缺血部分的神经元的缺损情况，促使神经功能逐渐恢复；康复技术能激发缺血区周围的神经突触再生，使非缺血区的功能逐渐提高[9]。而针康法则是将二者联合起来，即在头穴丛刺法的留针其间，同时开始各类康复锻炼，这是一个医治脑卒中的临床新型途径。临床研究表明，针康法可治疗脑卒中后期所致的肌张力增高或肌力下降等运动功能障碍、患肢偏瘫等多种并发症，提高患者生活质量[10]。而许多基础研究表明，针康法可保护已损伤的脑组织，帮助轴突重塑，使神经功能恢复；促进或抑制某些相关蛋白的表达，减轻细胞凋亡数量；促进脑损伤后血管新生，帮助损伤血管内皮的修复，改善脑部的血流量等功能[11]。本研究表明，针康法能有效改善脑损伤新生大鼠的神经功能损伤。有研究证明，PI3K/Akt 信号通路对细胞的生长、发育以及凋亡等过程均起到重要的调节作用[12]，该通路通过阻止细胞的凋亡，进而改善缺氧缺血性脑损伤。PI3K 是一种磷脂酰肌醇激酶，其主要作用是活化 Akt（又称蛋白激酶 B），而 Akt作为抗凋亡调节因子，可显著影响着细胞的存活。Bcl-2 家族对细胞凋亡也有明显的调节作用，它包含了以 Bcl-2、Bcl-xl 为主的抗凋亡因子与作用相反的、以Bad 为主的促凋亡因子[13-14]。细胞在缺氧缺血受损的条件下，可激活 PI3K，进而使 Akt 磷酸化，被激活后的 Akt 又可使促凋亡蛋白 Bad 磷酸化，并与 14-3-3 蛋白结合形成复合物，这就使得抗凋亡蛋白 Bcl-2/Bcl-xl与 Bad 分开，并在细胞质中游离，从而发挥其作用[15]。本次研究提示针康法能提高 Akt、14-3-3 蛋白活性，进而阻止细胞凋亡，使得脑部的神经功能逐步恢复。

表4 不同时间点各组脑组织 14-3-3 蛋白表达比较（，n =6）

表4 不同时间点各组脑组织 14-3-3 蛋白表达比较（，n =6）

注：与 A 组比较，## P ＜0.01；与 B 组比较，△P ＜0.05；与 C组比较，▲P ＜0.05；与 D 组比较，□P ＜0.05

细胞凋亡是一种由基因控制的细胞死亡过程，具有主动性和有序性，过程中有许多基因与蛋白因子参与，而能否表现出细胞凋亡在于促凋亡和抗凋亡因子的对抗结果，所以在有效的时间内调控这些因子从而阻止细胞凋亡对神经功能的恢复有重大意义[16-18]。本次研究说明针康法可有效减少缺氧缺血性脑损伤大鼠的细胞凋亡数，降低脑组织损伤。

吉林中医药2020年12期